1. OBJETIVO
Determinar la concentración de Hemoglobina, aprender hacer curvas de calibración y patrones para ello. También saber realizar medidas y cálculos matemáticos de absorbancia y concentración con el espectrofotómetro.
2. FUNDAMENTO
Se basa en la transformación de la hemoglobina en CIANMETAHEMOGLOBINA, al añadir a la mues-tra de sangre ciertos componentes del reactivo de DRABKIN. En primer lugar, el Fe2+ se oxida a Fe3+, dando lugar a metahemoglobina.
Luego, en presencia de cianuro potásico, pasa a cianmetahemoglobina, de color rojo y con un pico de absorción máximo a 540 nm y cuya concentración puede ser determinada por métodos colorimétricos, empleando un patrón de concentración conocida.
3. MATERIALES Y REACTIVOS
Tubos de ensayo Vaso de precipitado
Pipeta de 5ml Parafilm
Prepipeta Espectofotometro
Micropipeta Matraz aforado
Puntas de micropipeta
REACTIVOS --> Reactivo de Drabkin:
Ferricianuro potásico 0,6 mmol/l
Cianuro potásico 77 mmol/l
Dihidrógeno fosfato de potasio 2mmol/l
4. TÉCNICA
1. Como somos muchos en clase, preparamos 250 ml para que todos puedan utilizarlo.
2. Cogemos un matraz aforado y vertemos en él 1 frasco de 5 ml del reactivo y enrasamos con agua destilada (245 ml)
3. Tapamos con papel parafilm y mezclamos bien.
4. Trasvasamos la disolución a frascos de cristal oscuro, para su conservación y etiquetamos.
· Patrón de Hb (preparado comercial) .Realizamos diluciones seriadas con solución patrón.
1. Partimos de 15 g/dl de solución patrón (150 g/L)
2. Hacemos la primera dilución 1/2: 7,5 g/dl (75 g/L) de patrón: 0,5 ml de solución patrón + 0,5 ml de agua destilada.
3. Hacemos la segunda dilución 1/4: 3,75 g/dl de patrón: 0,5 ml de la disolución 1/2 + 0,5 ml de agua destilada (375 g/L)
Con cada patrón se hace el protocolo posterior donde pone patrón* y una curva calibración con excell.
PARA MEDIR EL RESULTADO EN EL ESPECTOFOTOMETRO:
1. Son necesarios los siguientes materiales y procesos:
· Longitud de onda: 540 nm.
· Cubeta: 1 cm paso de luz.
· Temperatura: 15-25ºC.
2. Ajustar el espectofotómetro a cero frente a agua destilada.
3. Pipetear:
4. Una vez hechas las mezclas con las cantidades descritas en la tabla, dejamos incubar 3 minutos a temperatura ambiente. * Se hace para cada uno de los patrones.
-Un grupo hará el blanco,
otro el patrón de 15 g/dL,
otro el patrón 7,5
y otro el de 3,5.
5. Leemos la absorbancia de los calibradores y la muestra, frente al Blanco de reactivo.
5. RESULTADOS
Blanco: 0
Patrón:
1. 0,295 3. 0,059
2. 0,124
Mi muestras: 0,475
6. CÁLCULOS
Concentración patrón (15 g/dL)---------Absorbancia patrón
X----------------------------------Absorbancia muestra
X= concent. Patrón x Absorb. Muestra/ Absorb. Patrón
O bien: A muestra/Apatron = C muestra/C patron;
C muestra (g/dL) = A muestra x Cpatron/ A patrón
Patrón 1: 15 x 0,475 / 0,295 = 9,31 g/dl
Patrón 2: 7,5 x 0,475 / 0,124 = 1,95 g/dl
Patrón 3: 3,5 x 0,475 / 0,059 = 0,43 g/dl
7. CONCLUSIONES
Esta práctica salió bien, y los resultados fueron los esperados.
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