1. OBJETIVO Y FUNDAMENTO
El estudio de la fragilidad osmótica de los hematíes valora la resistencia de los eritrocitos a soluciones de presión osmótica decreciente, en condiciones constantes de pH y de temperatura. Para ello, se enfrentan los hematíes problema a soluciones tamponadas de cloruro sódico cuya concentración es decreciente a partir de 9 gramos por mil (soluciones hipotónicas).
Cuando los eritrocitos están en contacto con soluciones hipotónicas, el agua penetra a través de su membrana y se hinchan. Si la entrada de líquido es excesiva, los hematíes se rompen y dejan libre toda la Hb que engloban (hemólisis).
En condiciones normales, un eritrocito puede aceptar sin hemolizarse una entrada de agua que incremente su volumen en un 70 % como máximo.
El objetivo de esta prueba es valorar la capacidad que tienen los glóbulos rojos de soportar un incremento de su contenido acuoso (ROE)
2. MATERIALES
Pipetas Pasteur. Centrifuga
Tubos de centrífuga Espectrofotómetro
Cubetas de fotometría Gradilla
Reactivos:
Suero fisiológico, preferiblemente tamponado a pH fisiológico (7,4). Esta solución salina puede prepararse de la siguiente forma:
9 g de cloruro sódico (NaCl).
2,7 g de fosfato sódico di‐básico (Na2HPO4.2H2O).
0,2 g de fosfato sódico mono‐básico (NaH2PO4.H2O).
1.000 ml de agua destilada.
Muestras: sangre venosa completa y anticoagulada
4. TÉCNICA
1. Preparar una las soluciones como se indica en la siguiente tabla:
2. Añadir a cada tubo 1 gota de sangre completa. ( en nuestro caso solo lo realizamos con los tubos impares). Esto ha de hacerse de forma que la gota llegue a la solución de cloruro sódico sin que toque la pared interna del tubo.
3. Agitar suavemente los tubos.
4. Dejar los tubos en reposo al menos 30 minutos, a temperatura ambiente (unos 25 ºC).
5. Centrifugar los tubos a 2.000 revoluciones por minuto (rpm), durante 5 minutos. En vez de centrifugar los tubos, también se pueden dejar simplemente en reposo, durante 3 horas.
4. RESULTADOS
La lectura de resultados puede ser visual o espectrofotométrica. En ambos casos, lo que se valora es la presencia o la ausencia de hemólisis en los tubos. En esta imagen se puede observar el resultado de los tubos realizados por nosotros. El tubo en el que mas hemólisis parcial se apreciaba era el número 11. El tubo con mas hemólisis total el 15.
Para realizar la lectura espectrofotométrica, se recoge el líquido sobrenadante, sin resuspender, y se mide la absorbancia (A) de cada uno de ellos, en un espectrofotómetro ajustado a una longitud de onda (λ) de 540 nm. Como blanco para la lectura espectrofotométrica se utiliza el líquido presente en el tubo nº 1, ya que al haber sido elaborado a partir de una solución de cloruro sódico a una concentración de 9 g/L, se supone que la hemólisis debe ser nula y el resultado debe ser 0.
Los resultados de cada tubo se ofrecen en forma de porcentaje (%) de hemólisis. Para ello se considera que la absorbancia medida en el líquido procedente del tubo nº 18 corresponde a un 100 % de hemóli-sis, ya que al haber sido preparado con la solución más hipotónica, será el más hemolizado. Por tanto, el porcentaje de hemólisis que corresponde a cada tubo se calcula con la siguiente fórmula:
A (absorbancia liquido presente en el tubo analizado)
% de hemólisis = ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ x 100
AM ( absorbancia del tubo 18)
NUESTROS RESULTADOS:
1 2,747
3 2,740
5 2,752
7 2,768
9 2,845
11 2,759
13 2,700
15 2,675
17 2,689
Estos resultados nos dieron los siguientes valores al introducirlos en el Excell:
5. CONCLUSIONES
Esta práctica resulto fácil salvo por la parte relacionada con el Excell, no conociamos bien de donde procedían los datos y tampoco usar el programa infórmatico.
En relación al laboratorio, los datos obtenidos por el espectrofotómetro no son muy fiables, ya que no sabemos si funciona bien el aparato.
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